InVivoMAb anti-mouse MHC Classe I (H-2Kb) (Clone: Y-3)

Reed, B. K., et al. (2015). “Un test di cattura semplice e versatile per valutare l’integrità strutturale dei reagenti MHC Multimer.”PLoS One 10 (9): e0137984. PubMed

Le risposte antigene-specifiche delle cellule T possono essere visualizzate utilizzando MHC: peptide multimers. Nei casi in cui i robusti controlli delle cellule T non sono prontamente disponibili per valutare l’integrità dei reagenti multimer prima di analizzare un campione limitato, sarebbe utile la capacità di valutare l’integrità strutturale dei multimer MHC prima del loro uso in esperimenti critici. Presentiamo un metodo per sondare l’integrità strutturale dei multimeri MHC utilizzando anticorpi specifici per determinanti conformazionali. Le perle rivestite con Ig anti-mouse sono incubate con anticorpo monoclonale specifico per la conformazione del mouse e quindi con multimer MHC con etichetta fluorescente. La capacità del tallone di catturare il multimero etichettato può essere misurata semi-quantitativamente mediante citometria a flusso. In questo modo, è possibile visualizzare la corretta piegatura dei multimer MHC e confrontare i lotti di multimer per il controllo qualità. Poiché ci sono epitopi conformazionali multipli formati da varie interazioni molecolari tra catena pesante, peptide e beta2M, questo test di cattura può valutare la fedeltà di ogni aspetto della struttura multimer, a seconda della disponibilità di anticorpi. L’approccio descritto potrebbe essere particolarmente utile per gli studi che utilizzano campioni insostituibili, compresi i campioni di pazienti raccolti negli studi clinici.

Zanker, D., et al. (2015). “Le cellule T che riconoscono un peptide influenzale 11mer complessato a H-2D (b) mostrano promiscuità per la lunghezza del peptide.”Immunol Cell Biol 93(5): 500-507. PubMed

Il repertorio delle cellule T viene selezionato in base ai complessi auto peptidici-MHC (major histocompatibility complex) nel timo. Sebbene la maggior parte delle cellule T periferiche riconoscano peptidi specifici derivati dall’agente patogeno complessati esclusivamente all’auto-MHC, alcuni possiedono una reattività crociata ad altri peptidi auto o estranei presentati da molecole auto-MHC; un fenomeno spesso definito promiscuità o degenerazione del recettore delle cellule T (TCR). La promiscuità del TCR è stata attribuita a varie condizioni autoimmuni. D’altra parte, è considerato un meccanismo affinchè un repertorio relativamente limitato di TCR si occupi di un repertorio antigenico potenzialmente molto più grande del peptide. Tale proprietà è stata utilizzata anche per bypassare l’auto-tolleranza per lo sviluppo di vaccini contro il cancro. Sebbene molti studi abbiano esplorato tale degenerazione per peptide della stessa lunghezza, pochi studi hanno riportato tali proprietà per peptidi di lunghezza diversa. In questo studio, abbiamo caratterizzato finemente la risposta delle cellule T CD8(+) specifica per un peptide 11mer derivato dalla proteina basica della polimerasi virale dell’influenza A 2. La linea di cellule T a breve termine, pur possedendo TCR altamente distorto, è stata in grado di reagire con peptidi multipli di diversa lunghezza che condividono la stessa sequenza principale. I dati Out hanno mostrato chiaramente l’importanza di valutazioni dettagliate e quantitative per tale specificità delle cellule T. I nostri dati sottolineano anche l’importanza della dimostrazione biochimica del peptide minimo naturalmente presentato.

Trujillo, J. A., et al. (2014). “Correlates strutturali e funzionali dell’immunità antivirale migliorata generata dagli epitopi eteroclitici delle cellule T CD8.”J Immunol 192 (11): 5245-5256. PubMed

I peptidi che si legano male alle molecole MHC di classe I spesso suscitano risposte a bassa funzionalità delle cellule T di avidità. La modifica del peptide alterando il residuo dell’ancora facilita l’affinità obbligatoria aumentata e può suscitare le cellule di T con avidità funzionale aumentata verso l’epitopo nativo (“heteroclitic”). È probabile che questo legame MHC aumentato aumenti l’emivita e la densità superficiale del complesso eteroclitico, ma non è noto esattamente come questa risposta potenziata delle cellule T si verifichi in vivo. Inoltre, l’epitopo eteroclitico ideale susciterà risposte delle cellule T che reagiscono completamente con l’epitopo nativo, massimizzando la protezione e riducendo al minimo gli effetti indesiderati fuori bersaglio. Tali epitopi sono stati difficili da identificare. In questo studio, utilizzando topi infettati da un coronavirus murino che codifica epitopi che suscitano risposte di avidità funzionale elevate (S510, CSLWNGPHL) e basse (S598, RCQIFANI), mostriamo che una maggiore espressione del peptide S598 ma non S510 ha generato cellule T con avidità funzionale migliorata. Pertanto, le risposte immunitarie possono essere aumentate verso epitopi delle cellule T con bassa avidità funzionale aumentando la densità Ag. Abbiamo anche identificato un epitopo eteroclitico (RCVIFANI) che ha suscitato una risposta delle cellule T con reattività crociata quasi completa con epitopo nativo e ha dimostrato una maggiore abbondanza di MHC/peptide rispetto al nativo S598. Le analisi strutturali e termiche della colata hanno indicato che la sostituzione di Q600V ha migliorato la stabilità del complesso peptide / MHC senza notevolmente alterare la superficie antigenica, con conseguente risposte altamente cross-reattive delle cellule T. I nostri dati evidenziano che l’aumento del display complesso peptide/MHC contribuisce all’efficacia dell’epitopo eteroclitico e descrive i parametri per massimizzare le risposte immunitarie che reagiscono in modo incrociato con l’epitopo nativo.

Bose, T. O., et al. (2013). “CD11a regola effector CD8 differenziazione delle cellule T e lo sviluppo della memoria centrale in risposta all’infezione da Listeria monocytogenes.”Infect Immun 81(4): 1140-1151. PubMed

le integrine beta2 (CD18) con catene alfa CD11a,-b,- c e-d sono importanti molecole di adesione necessarie per la migrazione dei leucociti e le interazioni cellulari. La carenza di CD18 porta a infezioni batteriche ricorrenti e scarsa guarigione delle ferite a causa della ridotta migrazione dei leucociti nei siti infiammatori. Le cellule T CD8 inoltre upregulate CD11a, CD11b e CD11c all’attivazione. Tuttavia, il ruolo che queste molecole svolgono per le cellule T CD8 in vivo non è noto. Per determinare la funzione delle singole integrine beta2, abbiamo esaminato le risposte delle cellule T CD8 all’infezione da Listeria monocytogenes nei topi CD11A-, CD11b-e CD11c-carenti. L’assenza di CD11b o CD11c non ha avuto alcun effetto sulla generazione di cellule T CD8 antigene-specifiche. Al contrario, l’entità della risposta primaria delle cellule T CD8 nei topi CD11a carenti è stata significativamente ridotta. Inoltre, la risposta nei topi CD11a(-/-) ha mostrato una ridotta differenziazione delle cellule effettrici di breve durata (KLRG1(hi) CD127(lo)), sebbene i livelli di produzione di citochine e granzyme B non siano stati influenzati. In particolare, la carenza di CD11a ha comportato una generazione notevolmente migliorata di celle di memoria centrale CD62L (+). Sorprendentemente, le cellule T CD8 prive di CD11a hanno montato una robusta risposta secondaria all’infezione. Presi insieme, questi risultati hanno dimostrato che l’espressione di CD11a contribuisce all’espansione e alla differenziazione delle cellule T CD8 primarie, ma può essere dispensabile per le risposte secondarie all’infezione.

Croft, N. P., et al. (2013). “Kinetics of antigen expression and epitope presentation during virus infection.”PLoS Pathog 9(1): e1003129. PubMed

Le attuali conoscenze sulla dinamica della presentazione dell’antigene alle cellule T durante l’infezione virale sono molto scarse nonostante siano di fondamentale importanza per la nostra comprensione dell’immunità antivirale. Qui usiamo un metodo avanzato di spettrometria di massa per quantificare simultaneamente la presentazione di otto complessi peptide-MHC del virus vaccinia (epitopi) sulle cellule infette e la quantità dei loro antigeni di origine a più volte dopo l’infezione. I risultati mostrano una sorprendente gamma di 1000 volte in abbondanza e una cinetica sorprendentemente diversa tra gli epitopi monitorati. La stretta correlazione tra l’insorgenza dell’espressione proteica e la visualizzazione dell’epitopo per la maggior parte degli antigeni fornisce il supporto più forte fino ad oggi che la presentazione dell’antigene è in gran parte legata alla traduzione e non alla successiva degradazione degli antigeni. Infine, mostriamo una completa disconnessione tra l’abbondanza di epitopi e la gerarchia di immunodominanza di questi otto epitopi. Questo studio evidenzia la complessità della presentazione dell’antigene virale da parte dell’ospite e dimostra la debolezza di modelli semplici che presuppongono che i livelli proteici totali siano direttamente collegati alla presentazione epitopica e all’immunogenicità.

Hammerling, GJ, et al. (1982). “Localizzazione di allodeterminanti su antigeni H-2Kb determinati con anticorpi monoclonali e topi mutanti H-2.”Proc Natl Acad Sci U S A 79 (15): 4737-4741. PubMed

La disposizione topografica dei determinanti antigenici sulla molecola H-2Kb è stata studiata mediante studi di competizione anticorpale con una serie di anticorpi monoclonali anti-Kb. Per l’identificazione dei residui di amminoacidi che partecipano alla formazione di topi mutanti H-2Kb allodeterminanti con sostituzioni di amminoacidi definite sono stati analizzati. I determinanti sono stati trovati per essere localizzati in almeno due cluster spazialmente separati sulla molecola H-2Kb. I determinanti di un cluster sono influenzati da mutazioni nelle posizioni aminoacidiche 155 e 156, mentre i determinanti di un secondo cluster sono modificati da sostituzioni aminoacidiche nelle posizioni 77 e 89. Per un terzo cluster di determinanti non è stato possibile identificare posizioni aminoacidiche rilevanti, ma i dati sulla concorrenza indicano che questo cluster è adiacente al secondo. I dati suggeriscono che i primi due domini di antigeni H-2 portano la maggior parte dei allodeterminanti.

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